王炸组合再出手！10x Genomics单细胞转录组 Cytek全光谱流式分析助力解析新冠后遗症免疫特征

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虽然现在疫苗和特效药陆续研发成功，但新冠后遗症还是不容小觑。今天，小编将为大家分享一篇利用10x Genomics单细胞转录组+Cytek全光谱流式分析解析新冠后遗症免疫特征的文章。

文章题目：Immune signatures underlying post-acute COVID-19 lung sequelae

发表期刊：Science Immunology

发表时间：2021年11月

发表单位：梅奥医学中心

摘要

2019年新冠 (COVID-19) 肺炎幸存者通常表现出长期肺部后遗症，但其潜在机制或相关的局部和全身免疫相关性尚不清楚。

在这里，研究人员对老年 COVID-19 康复者的病理生理和免疫特征进行了高维表征，并将局部和全身免疫特征与肺功能和肺部成像相关联。研究发现慢性肺损伤伴随着持续的呼吸道免疫改变。严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 特异性记忆 T 细胞和 B 细胞在感染部位富集。对肺免疫系统的详细评估表明，呼吸道 CD8+ T 细胞反应失调与急性 COVID-19 后肺功能受损有关。单细胞转录组分析确定了呼吸道 CD8+ T 细胞的潜在致病亚群，导致 COVID-19 后持续的后遗症。本研究结果揭示了可能支持老年人 SARS-CoV-2 肺炎后肺部后遗症发展的病理生理和免疫特征，这对治疗慢性 COVID-19 症状具有重要意义。

图1. Cytek全光谱流式与单细胞测序技术联用，

揭示新冠肺部后遗症免疫特征

研究内容

老年新冠重症康复者有极大的概率（>70%）发展为以肺部炎症、纤维化和肺功能受损为特征的肺部后遗症。为探究肺部后遗症相关的免疫学特征，研究人员利用Cytek全光谱流式细胞术，通过3个染色方案（共计48个表面及胞内标志物），对10名老年新冠康复者（实验组，CVD）及健康对照组（CON，n=5）的肺泡灌洗液（BAL）及血液样本进行了详尽的分析。发现血液样本中的NK细胞，BAL中的B细胞、γδT及CD8+T等细胞丰度在实验与对照组中存在显著差异，说明新冠感染可导致恢复期呼吸系统免疫图谱的持续改变。将免疫图谱的变化与肺功能/影像学异常进行相关性分析后，发现BAL中CD8+T细胞与肺功能/病理参数呈强相关（图2），表明呼吸系统CD8+T细胞在肺后遗症的形成中可能发挥重要作用。

图2. 新冠感染可导致与肺后遗症相关的

呼吸系统免疫图谱持续改变

在确定CD8+T细胞与肺后遗症的相关性后，研究人员开始了对CD8+T细胞亚群发育及功能的进一步全光谱流式分析（图3）。相比于CON组，CVD组BAL样本中CD69+CD103+/-组织常驻记忆T细胞(TRM)丰度增加。其中，CD69+CD103-TRM表达更高水平的EOMES、Granzyme B、Granzyme K（可促进成纤维细胞的激活）、CXCR4和KLRG1，其丰度与肺功能（DLCO/FEV1）指标呈强负相关（P=0.0054/0.0069），提示该细胞类群的致病作用。此外，研究人员发现BAL样本经SARS-CoV-2多肽池刺激后具有更高比例（相比于PBMC）可产生多种细胞因子的CD8+T细胞，说明新冠感染引发呼吸黏膜产生多功能记忆性CD8+T细胞。

图3. CD8+T细胞全光谱流式表征结果

与此同时，研究人员对CVD组中的6位康复者样本进行了10x Genomics 单细胞RNA测序分析。其中BAL样本的测序结果可将CD8+T细胞进一步分为三个类群（0、1、2类群，图4）：0、1号类群分别对应全光谱流式分析中的CD103+/CD103- TRM细胞，表现出相似的记忆特征，但类群1（CD103-TRM）表达更高水平的NKG7（细胞毒性分子）及Granzyme K，说明其具有更高的致病潜能；2号类群为高表达CXCR6、PRF1及TNF的CD8+T细胞，该组细胞中可检测到丰富的组织侵袭特征相关基因，其丰度与肺气体交换功能、肺磨玻璃样改变（GGO）具有较强相关性。

图4. 单细胞测序技术对CD8+T的进一步类群及功能分析

总结

本研究利用高维的免疫分析成功发现了老年新冠康复者肺部后遗症中具有不同致病机理的多个CD8+T细胞亚群，对新冠慢性肺部症状治疗方案的设计具有启示意义。作为定位疾病相关目标细胞的重要研究手段，全光谱流式高通量、超多色的表征性能与单细胞测序技术相辅相成，为文章提供了主要数据支持。如需了解更多实验与讨论细节，欢迎阅读参考文献原文。

参考文献

Cheon IS, Li C, Son YM, Sun J. et al., Immune signatures underlying post-acute COVID-19 lung sequelae. Sci Immunol. 2021. doi: 10.1126/sciimmunol.abk1741.

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