脑卒中（stroke，俗称中风）是一组突发的局部脑血液循环障碍引起神经功能障碍的疾病的总称，具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率等特点。其中，缺血性中风的发病率约占全部卒中的 80% 左右，并且急性缺血性中风 (AIS)可导致数百万人死亡和伤残。缺血性中风会引起强烈的神经炎症反应，对缺血损伤中心与外围发生的细胞类型和位置特异性分子变化知之甚少，有必要对缺血性大脑进行空间分辨单细胞转录组分析。
2024年2月7日，东南大学姚红红教授和南京航空航天大学姜伟教授共同通讯，东南大学医学院韩冰副教授和南京航空航天大学周顺衡博士为第一作者在 Science Translational Medicine上发表题为Integrating spatial and single-cell transcriptomics to characterize the molecular and cellular architecture of the ischemic mouse brain的研究论文。该研究使用10x Genomics空间转录组和单细胞转录组测序技术高分辨率地对缺血性卒中模型小鼠大脑的基因表达和细胞互作特征进行了深入解析，并通过细胞外囊泡介导实验验证 LGALS9-CD44 通路在促进卒中后脑修复中的重要作用，为卒中提供新的治疗策略。
文章题目：Integrating spatial and single-cell transcriptomics to characterize the molecular and cellular architecture of the ischemic mouse brain
期刊：Science Translational Medicine
影响因子：17.1
发表时间：2024年2月
主要技术：单细胞转录组测序，空间转录组测序
研究人员使用10x单细胞转录组测序和空间转录组测序技术对缺血性卒中模型小鼠大脑（PT）和对照组（Sham）进行实验，其中，空间转录组测序得到的19777个spots，分析PT组和Sham组的差异基因，结合梗死区域位置及基因表达相关性寻找缺血诱导基因。单细胞转录组测序得到的9799个单细胞结果，并定义了12种细胞类型。整合单细胞和空间转录组数据分析，探究CD44介导星胶细胞中LGALS9的功能。最后，构建模型小鼠实验，分析提高LGALS9和下调CD44后对卒中模型小鼠脑修复的作用（图1）。
图1 文章研究方法图解
1.10x Visium空间转录组揭示脑卒中小鼠大脑转录景观
研究人员使用10x Visium空间转录组测序对缺血性卒中模型小鼠大脑（PT）和假手术（Sham 对照组）进行实验，获得 19777 个 spots 的转录组数据，然后将每个聚类数据与小鼠的解剖大脑区域对应分析，揭示了缺血小鼠大脑中与不同大脑解剖区域相对应的独特基因图谱（图2）。对空间转录组学数据进行进一步分析，以探索中风对缺血半球不同区域的影响。结果显示，与免疫相关的基因变化在近端区域占主导地位，而与稳态相关的基因变化在远端区域占主导地位（图3）。
2.10x单细胞转录组测序揭示梗死周围区域的单细胞空间结构和细胞通讯特征
通过scRNA-seq分析，研究人员分别从10只接受PT手术的小鼠和10只接受假手术的小鼠的两个单细胞池中生成了9799个单细胞转录谱，并标记注释了12种主要细胞类型，发现小胶质细胞、巨噬细胞和单核细胞优先分布在 PIA_P，而其他类型的细胞则分布在 PIA_D，这表明缺血性大脑中存在区域细胞异质性（图4）。
通过CellChat深入了解梗死周围区域的病理特征，识别细胞间的通讯网络。与Sham组相比，研究人员发现 PT 组的相互作用强度和总数都显著增强（图5）。
图5 梗死周围的细胞通讯
3.整合单细胞和空间转录组数据揭示小胶质细胞和巨噬细胞的异质性
研究人员整合了空间转录组学和 scRNA-seq 数据，破解了这三种缺血诱导的小胶质细胞亚型的空间分布。通过绘制小鼠脑切片的细胞类型图，发现小胶质细胞是 Lgals9 的主要来源之一，巨噬细胞富集在梗死周围区域。综上，这些发现揭示了缺血性中风后组织中不同的空间亚型群体和亚型特异性基因表达模式，说明了小胶质细胞的异质性和多种巨噬细胞的浸润（图6）。
图6 通过 scRNA-seq 和空间转录组学揭示小胶质细胞和巨噬细胞的异质性
4.LGALS9可促进PT小鼠功能恢复，且CD44可介导其功能
接着，为了研究LGALS9对PT小鼠功能恢复的影响，研究人员首先构建含有LGALS9的细胞囊泡（EV），研究了LGALS9在PT诱导缺血损伤后小鼠梗死周围区域的时间表达。结果表明，RVG-EVs 在缺血性中风的超急性期介导了这三种半凝集素的脑输送，促进了中风小鼠感觉和运动功能的恢复（图7）。然后，研究人员利用CellChat分析鉴定了与LGALS9对脑卒中后大脑修复的有益作用相关的细胞相互作用。我们发现，LGALS9-CD44对假治疗小鼠和PT治疗小鼠的贡献率差异最大，这表明通过galectin通路进行的细胞相互作用的差异可能主要归因于LGALS9-CD44对（图8）。
图7 EV介导的LGALS9递送可促进PT小鼠的功能恢复
图8 CD44 在星形胶质细胞中介导 LGALS9 的功能
5.LGALS9-CD44 功能实验验证
最后，研究人员通过单细胞数据再聚类，流式细胞术分析，LFB染色，研究LGALS9 与 CD44 相互作用，发现可能通过增加 OPCs 和 I-OLs 的数量来促进中风后的髓鞘再形成，从而证实LGALS9-CD44 通路在促进卒中后脑修复中的重要作用（图9）。
图9 缺血性脑卒中后，Lgals9通过Cd44促进了OPC的增殖和分化
本研究基于10x Genomics的空间转录组测序和单细胞转录组测序技术，不仅描绘了缺血性卒中模型小鼠大脑的空间和单细胞转录图谱，还发现Lgals9-Cd44通路在促进卒中后脑修复中的重要作用，为开发卒中治疗方法提供了新的策略。同时，研究人员还搭建了一个在线数据库（http://Strokemap.cn），以提供缺血性大脑的高分辨率转录图谱，作为进一步研究卒中和其他脑部疾病的资源。
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