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单分子荧光检测原理
发布日期:2014-05-26  查看次数: 33 次  
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        单分子荧光检测是单分子检测中最常用的方法。标记在大分子上各个荧光基团的各种特性的变化反应了有关分子间相互作用,酶活性,反映动力学,构像动力学,分子运动自由度,及在化学静电环境下活性改变的信息。

        该方法对宿主影响小,样品的稀溶液中荧光发射检测较为灵敏,背景值低,信噪比高。

        分子荧光分析法低基本要点:

        1. 理解分子荧光法的基本原理;

        2. 掌握分子荧光发射光谱的特;

        3. 了解荧光光谱仪的组成及各部分作用;

        4. 掌握分子荧光分析法的定量分析方法及主要应用范围。


• 基本原理
一. 分子荧光的发生过程
(一)分子的激发态——单线激发态和三线激发态

 大多数分子含有偶数电子,在基态时,这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中,成对自旋,方向相反,电子净自旋等于零:S=½+(-½)=0,其多重性 M=2S+1=1 (M 为磁量子数),因此,分子是抗(反)磁性的,其能级不受外界磁场影响而分裂,
称“单线态”;

图1 单线基态(A)、单线激发态(B)和三线激发态(C)

    当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后,被激发跃迁到能量较高的轨道上,通常它的自旋方向不改变,即ÄS=0,则激发态仍是单线态,即“单线(重)激发态”;
    如果电子在跃迁过程中,还伴随着自旋方向的改变,这时便具有两个自旋不配对的电子,电子净自旋不等于零,而等于1: S=1/2+1/2=1 其多重性: M=2S+1=3
    即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂,这种受激态称为“三线(重)激发态”;
“三线激发态” 比 “单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的,即跃迁几率非常小,只相当于单线态 → 单线态过程的 10-6~10-7。
(二)分子去活化过程及荧光的发生:
    (一个分子的外层电子能级包括 S0(基态)和各激发态S1,S2,…..,T1…..,每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级)
    处于激发态的分子不稳定,在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量(辐射或非辐射跃迁)回到激态,这个过程称为“去活化过程”,这些途径为:
1. 振动弛豫:在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子(环境),在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动弛豫。

图2 分子吸收和发射过程的能级图
2. 内转换:当激发态S2 的较低振动能级与S1 的较高振动能级的能量相当或重叠时,分子有可能从S2 的振动能级以无辐射方式过渡到S1 的能量相等的振动能级上, 这一无辐射过程称为“内转换”。
       (“ 内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间)
 3. 外转换:激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用(如碰撞)而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程称“外转换” 。
4.系间跨跃:当电子单线激发态的最低振动能级与电子三线激发态的较高振动能级相重叠时,发生电子自旋状态改变的 S—T 跃迁,这一过程称为 “系间跨跃” 。
    (含有高原子序数的原子如 Br2、I2 的分子中,由于分子轨道相互作用大,此过程最为常见。)
5. 荧光发射:当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时,第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射(光子)跃回到基态的不同振动能级,此过程称为 “荧光发射”。
    如果荧光几率较高,则发射过程较快,需10-8秒。(它代表荧光的寿命)
由于不同电子激发态(S)的不同振动能级相重叠时,内转换发生速度很快(容易),在10-11~1013秒内完成,所以通过重叠的振动能级发生内转换的几率要比由高激发态发射荧光的几率大的多,因此,尽管使分子激发的波长有短(λ1)有长( λ2 ),但发射荧光的波长只有λ3(>λ1>λ2)。
6. 磷光发射:第一电子三线激发态最低振动能级的分子以发射辐射(光子)的形式回到基态的不同振动能级,此过程称为 “磷光发射”。
    (磷光的波长λ4较荧光的波长λ3稍长,发生过程较慢 约 10-4~10s)
    由于三线态 — 单线态的跃迁是禁阻的,三线态寿命比较长,(10-3~10s 左右),若没其它过程同它竞争时,磷光的发生就有可能;由于三线态寿命较长,因而发生振动弛豫及外转换的几率也高,失去激发能的可能性大,以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象。因此,试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光。
    总之:处于激发态的分子,可以通过上述不同途径回到基态,哪种途径的速度快,哪种途径就优先发生。
    如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较快,则荧光发生几率高,强度大。
    如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较慢,则荧光很弱或不发生。
(三)荧光量子效率:
物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值。
Φ 数值在 0~1 之间。他的大小取决于物质分子的化学结构及环境(t0c、pH 、溶剂等)。
二. 激发光谱与荧光(发射)光谱
1. 激发光谱:将激发荧光的光源用单色器分光,连续改变激发光波长,固定荧光发射波长,测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F),作F—λ光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长λex,选用 λex可得到强度最大的荧光。
2. 荧光光谱:选择λex作激发光源,用另一单色器将物质发射的荧光分光,记录每一波长下的 F,作 F- λ 光谱图称为荧光光谱。
荧光光谱中荧光强度最强的波长为 λem 。
λex 与 λem一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。

三. 荧光与分子结构的关系

1. 分子结构与荧光

具有p、p及n、p电子共轭结构的分子能吸收紫外和可见辐射而发生p-p* 或n - p* 跃迁,然后在受激分子的去活化过程中发生p*- p或p*- n 跃迁而发射荧光。

发生p- p* 跃迁分子,其摩尔吸光系数(å)比 n - p* 跃迁分子的大100—1000倍,它的激发单线态与三线态间的能量差别比n - p* 的大的多,电子不易形成自旋反转,体系间跨越几率很小,因此,p- p* 跃迁的分子,发生荧光的量子效率高,速率常数大,荧光也强。

所以——只有那些具有p- p共轭双键的分子才能发射较强的荧光;

p电子共轭程度越大,荧光强度就越大(lex与lem长移)大多数含芳香环、杂环的化合物能发出荧光,且p电子共轭越长,F越大。

2. 取代基对分子发射荧光的影响

(1)(苯环上)取代给电子基团,使p共轭程度升高à荧光强度增加:如–CH3,–NH2 ,–OH ,–OR等。

(2)(苯环上)取代吸电子基团,时荧光强度减弱甚至熄灭:如:,–COOH ,–CHO,–NO2 ,–N=N–。

(3)高原子序数原子,增加体系间跨越的发生,使荧光减弱甚至熄灭。如:Br,I 。

3. 共面性高的刚性多环不饱和结高的分子有利于荧光的发射。

例如:荧光素呈平面构型,其结构具有刚性,它是强荧光物质;而酚酞分子由于不易保持平面结构,故而不是荧光物质。 

上一条单分子荧光分析技术揭示解旋酶作用机制 暂无信息:下一条
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